NobleRyder RIPA裂解液(強(qiáng))
NobleRyder RIPA裂解液(強(qiáng)) 即用型液體試劑 P4813-100ml
NobleRyder RIPA裂解液(強(qiáng))
產(chǎn)品簡(jiǎn)介：
多種成分均可以從細(xì)胞中提取總蛋白，例如 Triton、SDS、NP-40 等。RIPA 裂解液（強(qiáng)） (Enhanced RIPA Lysis Buffer )，是采用一種經(jīng)典的細(xì)胞組織快速裂解，并獲得總蛋白的裂解液，其裂解強(qiáng)度大于 NP-40 裂解液、RIPA 裂解液(中)。所獲得的蛋白質(zhì)可以用于 Western，免疫沉淀(Immunol Precipitation，IP)等。Enhanced RIPA Lysis Buffer 主要由 Tris 、NP-40、sodium deoxycholate 等組成，并含有多種蛋白酶抑制劑成分，可以有效抑制蛋白的降解，并維持原有的蛋白間相互作用。
產(chǎn)品組成：
| 編號(hào) 名稱 | P4813 | Storage |
| Enhanced RIPA Lysis Buffer | 100ml | -20℃ |
| PMSF(100mM) | 1.5ml | -20℃ |
| 使用說(shuō)明書(shū) | 1份 | |
操作步驟(僅供參考)：
(一)貼壁培養(yǎng)細(xì)胞
1、 取 Enhanced RIPA Lysis Buffer 室溫溶解混勻，加入 PMSF，使 PMSF 終濃度為 1mM。
2、 去除貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)液，用 PBS、NS 或無(wú)血清培養(yǎng)液清洗 1 次，低速離心，棄上清，留取沉淀。
3、 按照 6 孔板每孔加入 150～250μl 含有 PMSF 的裂解液的比例，加入 RIPA Lysis Buffer 。移液器輕輕吹打，使裂解液和細(xì)胞充分接觸。置于冰上或 4℃裂解 15～30min，通常裂解液作用于細(xì)胞 1～3 秒內(nèi)，細(xì)胞就會(huì)被裂解。通常 6 孔板每孔細(xì)胞加入 150μl 裂解液已經(jīng)足夠，但如果細(xì)胞密度非常高可以適當(dāng)加大裂解液的用量到 200～250μl。
4、 10000～12000g，4℃離心 5～10min(如無(wú)低溫離心機(jī)，室溫下離心亦可)，取上清。5、 進(jìn)行后續(xù)的 SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。
(二)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞
1、 取 Enhanced RIPA Lysis Buffer 室溫溶解混勻，加入 PMSF，使 PMSF 終濃度為 1mM。
2、 低速離心懸浮細(xì)胞，棄上清，收集沉淀。
3、 用手指輕彈細(xì)胞，使其松散。按照 6 孔板每孔細(xì)胞加入 150～250μl 含有 PMSF 的裂解液的比例，加入 Enhanced RIPA Lysis Buffer。通常 6 孔板每孔細(xì)胞加入 150μl 裂解液已經(jīng)足夠，但如果細(xì)胞密度非常高可以適當(dāng)加大裂解液的用量到 200～250μl。再用手指輕彈以充分裂解細(xì)胞，充分裂解后應(yīng)沒(méi)有明顯的細(xì)胞沉淀。
4、 10000～12000g，4℃離心 5～10min(如無(wú)低溫離心機(jī)，室溫下離心亦可)，取上清。5、 進(jìn)行后續(xù)的 SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。
(三)組織樣本
1、取 Enhanced Lysis Buffer 置于室溫溶解混勻，，加入 PMSF，使 PMSF 終濃度為 1mM。
2、把組織jian切成細(xì)小的碎片，越小越好。取在液氮或超低溫冰箱中冷凍 30min 以上的組織，迅速用液氮研磨，研磨過(guò)程盡量控制在 1～2min 之內(nèi)，以減少蛋白的降解。
3按照每 20mg 組織加入 150～250μl 裂解液的比例加入含有 PMSF 的裂解液。冰上或 4℃
裂解 15-30min。
4、步驟 3、4 亦可以采用如下過(guò)程：按照每 20mg 組織加入 150～250μl 裂解液的比例加入含有 PMSF 的 Enhanced RIPA Lysis Buffer。用玻璃勻漿器或組織研磨器勻漿，直至充分裂解，該過(guò)程盡量控制在 1～2min 之內(nèi)，以減少蛋白的降解。
5、 10000～12000g，4℃離心 5～10min(如無(wú)低溫離心機(jī)，室溫下離心亦可)，取上清。6、 進(jìn)行后續(xù)的 PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。
注意事項(xiàng)：
1、 去除貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)液后，如果血清中的蛋白沒(méi)有干擾，可以丌用清洗。
2、 如果裂解丌充分可以適當(dāng)增加裂解液的用量，如果需要高濃度的蛋白樣品，可以適當(dāng)減
少裂解液的用量。
3、 如果細(xì)胞量較多，必需分裝成 50～100 萬(wàn)細(xì)胞/離心管，然后再裂解。大團(tuán)的細(xì)胞較難
裂解充分，而少量的細(xì)胞由于裂解液容易和細(xì)胞充分接觸，相對(duì)比較容易裂解充分。
4、 如果組織樣品本身非常細(xì)小，可以適當(dāng)剪切后直接加入裂解液裂解，通過(guò)強(qiáng)烈 Vortex使樣品裂解充分。然后同樣離心取上清，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
5、 溶解 NobleRyder RIPA Lysis Buffer 時(shí)，應(yīng)盡量縮短溶解時(shí)間，避免有效成分失效。
6、 裂解產(chǎn)物中經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)一小團(tuán)透明膠狀物，屬正?，F(xiàn)象。該透明膠狀物為含有基因組 DNA 等的復(fù)合物。在丌檢測(cè)和基因組 DNA 結(jié)合特別緊密的蛋白的情況下，可以直接離心取上清用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)；如果需要檢測(cè)和基因組結(jié)合特別緊密的蛋白，則可以通過(guò)超聲處理打碎打散該透明膠狀物，隨后離心取上清用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。如果檢測(cè)一些常見(jiàn)的轉(zhuǎn)錄因子，例如 NF-KB、p53 等時(shí)，通常丌必進(jìn)行超聲處理，就可以檢測(cè)到這些轉(zhuǎn)錄因子。
7、 細(xì)胞裂解的操作步驟，應(yīng)置于冰上或 4℃進(jìn)行。
有效期： 12 個(gè)月有效。
NobleRyder RIPA裂解液(強(qiáng))
